如何使用吖啶橙/碘化丙啶测量细胞活力：原理与步骤

在生命科学研究领域，无论你是在研究潜在的新药物化合物，还是监测细胞培养的健康状况，测量细胞活力都至关重要。在各种可用的技术中，吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色方法提供了一种简单而灵敏的方法来区分活细胞和死细胞。在本文中，我们将讨论AO/PI染色方法背后的原理以及使用AO/PI测量细胞活力的过程。

原理

吖啶橙（AO): AO 是一种分子量为 265 Da 的小分子，可以穿透活细胞和死细胞。一旦进入细胞，它就会选择性地与核酸结合，并发出独特的绿色荧光。当 AO 与 DNA 结合时，其激发峰值约为 500 纳米，发射峰值为 525 纳米。

碘化丙啶(PI): PI分子量为668 Da，不能穿透活细胞膜。PI能穿透膜受损细胞，如垂死或死亡的细胞。当 PI 与 DNA 结合时，其激发峰值为 535 纳米，发射峰值为 617 纳米，因此会发出独特的红色荧光。

当使用 AO/PI 混合物对细胞进行染色时，在适当光源的激发下，活细胞会发出绿色荧光，而死细胞则会发出红色荧光。具体来说，AO 能穿透所有细胞并与核酸结合，而 PI 只能穿透死细胞，然后与死细胞中的核酸结合。由于活细胞只允许 AO 穿透，因此在活细胞中观察不到 PI 的荧光。在死细胞中，两种染料都能穿透，理论上可以观察到 AO 和 PI 的荧光。然而，由于 AO 发射被 PI 吸收的 FRET 现象，在死细胞中只能选择性地观察到 PI 的荧光。这意味着，当 AO 和 PI 一起使用时，在死亡细胞中无法观察到 AO 的荧光。使用荧光显微镜或采用荧光显微镜原理的自动细胞计数器，可以在活细胞中观察到 AO 的绿色荧光，而在死细胞中观察到 PI 的红色荧光。

过程

1. 准备你的细胞:
① 首先从培养物中收获细胞。
②用离心机收集细胞，再用PBS重悬。

2. 染色过程:
① 准备 10x AO/PI 染色液 （如吖啶橙/碘化丙啶染色液，Cat # F20331，Logos Biosystems）。.
② 将 10 uL 细胞悬液与 2 uL 吖啶橙/碘化丙啶染色液混合。AO/PI 可立即对细胞进行染色，无需进一步孵育。

3. 细胞计数
使用荧光显微镜:
①将 10 uL 染色细胞装入血细胞计数器。
②使用装有适当滤光片的荧光显微镜将细胞聚焦，颜色将是很明显的:绿色荧光细胞代表活细胞，红色荧光细胞代表死细胞。
③要确定细胞浓度，可对血细胞计数器网格上五个大方格中的所有细胞进行计数。
每毫升细胞浓度=(每格平均细胞数/一格体积(0.1 μL)×稀释系数

✓ 如果使用10x AO/PI，稀释系数为1.11

④测定细胞活力，使用以下公式:
活力百分比=(绿色荧光细胞数/细胞总数)×100

使用自动荧光细胞计数器 (LUNA-FL^TM, LUNA-FX7^TM)
① 将10 uL染色细胞装入细胞计数室载玻片 (例如，PhotonSlide, Cat# L12005)
②将载玻片插入细胞计数器，按 “Count（计数）”键。
③自动细胞计数器将自动显示所有必要信息，如细胞浓度、细胞存活率和细胞大小等。

使用 AO/PI 时的实用技巧

使用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色法测量细胞活力时，需要注意几个要点，以确保结果准确。下面是一些需要记住的重要提示：

染料浓度的一致性: AO和PI的浓度应在实验中一致，以获得可比的结果。染料浓度的任何变化都可能影响染色强度以及活细胞和死细胞的区分。

避光保护： AO 和 PI 都具有光敏性。为防止染料降解或光漂白，应始终在黑暗或微光条件下处理和储存染料。

时间: AO/PI 染色过程相对较快。细胞长时间接触染料会导致结果不准确。不同样本的孵育时间必须保持一致。

样品处理: 将细胞悬浮液与染料轻轻混合是防止细胞受损和确保染色均匀的关键。但应避免剧烈摇晃或移液，以免损伤细胞。

染料溶液的新鲜度: 检查染料溶液的保质期。随着时间的推移，染料可能会降解或受到污染，从而影响染色效果。

校准和控制： 使用自动细胞计数器时，确保用对照样本校准细胞计数器。对于对照样本，可使用已知浓度的荧光校准珠混合物 (例如，LUNA-FX 校准珠试剂盒，Cat# F7310) or 或细胞计数器验证片-FL（Cat# L72030）。

其他确认方法: 用其他方法验证验证AO/PI染色结果总是一个好主意，尤其是在观察到意外结果或结果有重大影响时。

请记住，虽然 AO/PI 染色法是评估细胞活力的一种有用而快速的技术，但要获得准确和可重复的结果，必须保持标准化的程序

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